肿瘤微生物群的空间分布如何影响肿瘤异质性？ | 微生物专题
论文标题：Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer
刊登日期：2022年11月
发表杂志：Nature
影响因子：74.62
技术手段：16S rDNA测序、空间转录组、单细胞转录组
（一）研究背景
01
癌症患者肿瘤的恶性细胞被复杂的非恶性细胞包围，根据其细胞类型和丰度可能具有促肿瘤或抗肿瘤作用。大量的基因组学研究发现，人类主要的癌症类型中，超过33种都含有瘤内微生物。瘤内微生物参与形成特定的肿瘤微环境，能够干预肿瘤的发生、转移、免疫逃逸和化疗抗性，进而影响患者对治疗的反应。但是瘤内微生物在组织中的分布及其与宿主细胞互作影响肿瘤微环境仍需进一步阐明。
02
图1 研究思路
03
1、肿瘤内微生物群的异质性
图2 肿瘤组织中肿瘤内微生物群的不均匀分布
作者对11名结直肠癌（CRC）患者肿瘤的44块组织进行了16S rRNA基因测序，发现肿瘤内微生物群的组成（门和属水平）在不同患者中有差异。Beta多样性分析发现超过三分之一的患者具有相对稳定的微生物组成（核梭杆菌：F. nucleatum），大多数患者（n=7）在肿瘤内微生物组中表现不同程度的异质性（图2a-d），表明患者肿瘤组织中的微生物是不均匀分布的，并通过FISH分析证实了这一观点。
图3 肿瘤内细菌的空间分布
作者通过10x Visium空间转录组学探究CRC标本和口腔鳞状细胞癌（OSCC）标本中瘤内微生物群的空间分布。对组织处理后每个spot捕获的微生物转录本（主要由核糖体RNA组成）为整个瘤内组织中细菌转录组提供了空间坐标，单独的微生物转录本有独特的UMI标记能够量化细菌转录负荷（图3a）。使用GATK PathSeq17对得到的测序数据进行评估，将原位测序reads分类解析到属水平，FISH证实了瘤内细菌的空间分布（图3b-c）。在OSCC和CRC肿瘤中分别有28%和46%的spots鉴定出细菌转录本，并确定微单胞菌（Parvimonas）、嗜胨菌属（Peptoniphilus）和梭杆菌（Fusobacterium）是OSCC肿瘤中最优势的属，而Fusobacterium和拟杆菌（Bacteroides）是CRC肿瘤中最优势的属(图1e)。
2、微生物定植在肿瘤内生态位
图4 肿瘤相关的微生物群存在于具有低增殖率的高免疫抑制微孔中
鉴于肿瘤内微生物群在单个肿瘤组织中具有异质性，作者试图确定这种空间分布是否与TME内的不同功能相关。作者通过量化与抗肿瘤免疫和癌症进展相关的 77 种蛋白质的表达谱，对所感兴趣的免疫区室或上皮癌区室中的蛋白进行分区分析（细菌阴性区Bac-与细菌阳性区Bac+）（图5）。在 OSCC 和 CRC肿瘤的CD45+免疫区室中，细菌存在于高度免疫抑制的微生态位，其特征是成熟 CD66b+ 骨髓细胞以及免疫抑制分子ARG1（精氨酸酶1）和免疫检查点蛋白CTLA4（细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4）的上调（图5b）。此外，在两种癌症类型中，ERK1和ERK2磷酸化水平升高，这表明骨髓对肿瘤内细菌的反应可能是通过激活MAPK信号通路发生的。
图5 肿瘤相关微生物群对局部微生态位的影响
在连续的组织切片中，使用抗泛细胞角蛋白（PanCK）和CD45免疫荧光可标记上皮癌细胞和免疫区室在肿瘤组织的分布。在两种癌症类型的 PanCK+上皮肿瘤区室中，细菌定植区域（Bac+）的血管化程度低于细菌阴性区域（Bac-），平滑肌肌动蛋白（SMA）表达减少，增殖水平降低。在OSCC和CRC肿瘤组织的细菌定植微生态位中，肿瘤抑制因子p53野生型构型的蛋白质表达显着降低，表明细菌定位与TME内高度转化的癌细胞相关。细菌定植的微生态位显着增加了CRC肿瘤中JNK、ERK1和ERK2以及P38的磷酸化水平，这一通路即为在细菌响应中被激活的信号通路。
3、微生物驱动的单细胞异质性
在人类癌症类型中，宿主细胞内存在细菌已被报道，然而关于入侵细菌的身份及其与宿主细胞相互作用和关联如何影响TME内的细胞功能知之甚少。作者通过引入靶向细菌16S rRNA 保守区域的引物开发了侵袭-黏附定向表达测序法 （INVADEseq），利用该方法检测7位OSCC 患者的新鲜肿瘤组织。共聚焦成像结果显示，在组织分离成单个细胞后，这些患者肿瘤的单个细胞内含有细胞粘附细菌和细胞内细菌 (图6a)。scRNA-seq结果显示瘤内微生物区系以 Fusobacterium（占 34%）和密螺旋体（Treponema）（29.8%）为主（图6b）。
为了确定这两种菌属是否影响上皮细胞的信号通路，作者将Fusobacterium或Treponema阳性的单上皮细胞与上皮细胞簇中的细菌阴性细胞 (Total Bac-) 进行比较。GSEA分析结果显示IFN和JAK-STAT信号显著上调（伴随SERPIN家族分子表达增加），趋化因子 （如CXCL10, CXCL11等）以及金属蛋白酶（MMP9 和 MMP3）也显著上调（图6d-e）。另外还比较了泛细菌阳性（Total Bac+）与细菌阴性（Total Bac-）细胞之间的差异，发现与感染特定菌属的细胞相比，泛细菌阳性上皮细胞中与癌症进展相关的基因表达和细胞信号通路仅受到很小程度影响。综上表明瘤内微生物可以在免疫和上皮细胞群的单细胞水平上驱动患者肿瘤的异质性。
4、瘤内微生物诱导癌细胞迁移
为了评估肿瘤内微生物群的主要成员与免疫或上皮癌细胞的直接相互作用，作者利用体外共培养的方法，将CRC上皮球状体与从CRC分离的F. nucleatum共培养，然后包埋到含有均匀分布中性粒细胞的胶原蛋白基质中（图7a）。通过活细胞共聚焦显微镜发现，在没有F. nucleatum的情况下，中性粒细胞在上皮球状体内自由迁移；在有F. nucleatum的情况下，中性粒细胞通过降低其迁移能力来应对细菌感染。中性粒细胞招募和保留到感染癌细胞球体上，表明肿瘤内微生物群在患者肿瘤细菌定植的微孔内的中性粒细胞富集中起积极作用。中性粒细胞簇的形成伴随着 ERK 和p38 MAPK 磷酸化水平的显著增加（图7b），其部分原因是髓系对瘤内细菌的反应。
受F. nucleatum感染的CRC上皮细胞从球形肿块中分离出来，并作为单个上皮细胞迁移到周围的胶原凝胶中（图7f）；相比之下，未感染的肿瘤上皮细胞作为一个集体入侵，整个球形团块以一定扩张速率通过凝胶扩散（图7g），在迁移的癌细胞侵入胶原凝胶时检测到细胞内细菌（图7h）；菌体的侵入改变了受感染癌细胞的运动模式，从而在功能水平上促进了细胞的异质性（图7i-k）。
为了识别所涉及的信号通路的变化，使用nCounter平台分离含有F. nucleatum的球体进行转录组测序，F. nucleatum导致参与癌症进展的信号通路显著上调，包括细胞外基质重塑、转移核细胞黏附核迁移以及EGFR和NF-κB信号通路等，此外，F. nucleatum处理过的球状体表现出与细胞周期、DNA损伤修复和p53信号相关的信号通路下调（图7l-m）。综上所述，来自人类CRC的F. nucleatum在细菌感染部位积极诱导髓系细胞的招募，促进CRC上皮细胞的转录变化，从而增加对周围环境的入侵。
04
该研究通过扩增子测序、scRNA-seq、空间转录组等技术手段揭示了肿瘤内微生物群在人类肿瘤中的异质分布并导致肿瘤细胞异质性，且瘤内微生物诱导肿瘤细胞的侵袭迁移。通过空间转录组学和单细胞RNA测序方法，分析了口腔鳞癌和结直肠癌患者的肿瘤样本，并结合功能研究，发现瘤内菌群的空间分布不是随机的，其在肿瘤内的分布模式与肿瘤微环境的异质性密切相关。特定细菌对瘤内细胞的感染/黏附可以在单细胞层面改变细胞特征，并可能通过影响抗肿瘤免疫和癌细胞转移，促进癌症进展。
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